1. Organisasi Dalam Laboratorium Kultur Jaringan
Di setiap laboratorium dimana teknik kultur jaringan
digunakan harus mempunyai sejumlah fasilitas yang mencakup al.:
- Ruang pencucian
- Ruang persiapan media, sterilisasi dan penyimpanan
- Ruang transfer aseptik
- Ruang kultur atau inkubator yang lingkungannya
terkontrol
- Ruang pengamatan dan koleksi data Diagram
laboratorium kultur jaringan dapat dilihat pada gambar B-2.1.
a. Ruang Pencucian
Ruang pencucian harus mempunyai bak cuci, meja kerja
yang terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam dan basa, rak pengering dan
mempunyai saluran untuk air demineralisasi atau destilasi, ruang untuk tempat
oven pengering, alat/mesin pencuci dan pengering, serta rak atau lemari
penyimpanan alat.
b. Ruang Persiapan Media
Di dalam ruang persiapan media harus tersedia tempat
untuk penyimpanan bahan-bahan kimia, gelas kultur dan penutupnya, dan peralatan
gelas yang diperlukan untuk pembuatan media. Meja yang kokoh atau ”bench” untuk
penyimpanan ”hot plate magnetic stirrer”, pH meter, timbangan, dan dispenser
harus tersedia. Peralatan lain yang biasanya ada di ruang persiapan dan
pembuatan media antara lain alat vaccum, distiling unit, bunsen, refrigerator
(kulkas) dan freezer untuk penyimpanan larutan stok dan bahan kimia, mikrowave,
kompor gas, oven dan autoclave untuk sterilisasi mdia, peralatan gelas dan peralatan
lain. Didalam pembuatan media kultur, bahan-bahan kimia yang digunakan harus
yang bertaraf analitik dan penimbangannya harus baik dan benar. Agar lebih
akurat, dalam pembuatan media harus dilakukan tahap demi tahap dan bahan-bahan
yang digunakan harus di ”checklist”. Air yang digunakan dalam pembuatan media
harus berkualitas tinggi yang mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi. Air
ledeng atau sumur tidak digunakan untuk pembuatan media karena mengandung
kation-kation (amonium, kalsium, besi, magnesium natrium, dll.), anion-anion
(bikarbonat, klorida, flourida, fosfat, dll.), mikroorganisme (algae, jamur,
bakteri), gas-gas (oksigen, CO2, nitrogen) dan bahan-bahan lain (minyak, bahan
organik dll.). Air yang digunakan dalam kultur jaringan harus mempunyai standar
type II (minimum) yaitu bebas pirogen, gas, dan bahan organik dan mempunyai
konduktivitas elektrik kurang dari 1.0 µmho/cm. gambar Metoda yang paling umum
untuk pemurnian air standar type II adalah dengan deionosasi yang diikuti
dengan satu atau dua destilasi gelas. Deionisasi menghilangkan dari bahan yang
bersifat ionik dan proses destilasi menghilangkan molekul-molekul organik,
mikroorganisme dan pirogen. Metode-metode lain yang dapat digunakan untuk
mendapatkan air murni type II adalah
(1) penyaringan dengan cara absorpsi, dengan
menggunakan karbon aktif untuk menghilangkan kontaminan organik dan bebas
klorine;
(2) penyaringan dengan membran, yang menghilangkan
bahan-bahan partikulat dan kontaminasi oleh bakteri; dan
(3) reverse osmosis, yang menghilangkan sekitar 99%
bakteri, bahan organik dan bahan partikulat.
c. Ruang Transfer
Teknik kultur jaringan dapat berlangsung dengan sukses
apabila dilakukan dibawah kondisi laboratorium yang sangat bersih. Oleh karena
itu pemindahan atau transfer biakan dikerjakan dalam ruang transfer steril atau
laminar air flow. Laminar air flow yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman
adalah tipe horizontal dan dirancang dengan mempunyai ruangan yang bebas dari
partikel debu yang halus dan dilengkapi dengan sinar ultra violet (UV) serta
unit penyaring udara. Penyaring udara harus mempunyai filter udara dengan
efisiensi tinggi atau ”high-efficiency particulate air (HEPA filter). HEPA
filter harus mempunyai pori sekitar 0.3 µm dengan efisiensi kerja berkisar 99.97
– 99.99%. Semua permukaan ruang kerja dalam laminar harus dirancang dan
mempunyai konstruksi sedemikian rupa sehingga debu dan mikroorganisme tidak
dapat berakumulasi dan permukaan tempat kerja dapat mudah dibersihkan dan
diidisinfeksi.
d. Ruang Kultur
Semua jenis kultur harus disimpan dalam tempat yang
terkontrol baik temperatur, sirkulasi udara, kelmbaban maupun kualitas dan
lamanya cahaya. Faktor-faktor lingkungan tersebut akan mempengaruhi proses
pertumbuhan dan diferensiasi biakan baik secara langsung maupun tidak langsung.
Kultur protoplas, suspensi sel dan kultur anther adalah yang paling sensitif
terhadap kondisi lingkungan. Suhu ruang kultur untuk pertumbuhan umumnya
berkisar antara 15o – 30oC, dengan fluktuasi kurang dari ±0.5oC; akan tetapi kisaran
suhu yang lebih besar mungkin diperlukan untuk tujuan percobaan. Ruang kultur
harus mempunyai pencahayaan hingga 10.000 lux. Suhu dan cahaya harus dapat
diprogram selama 24 jam. Ventilasi udara harus baik dengan kelembaban berkisar
20-98%.
2. Peralatan dan Bahan Dasar Dalam Laboratorium Kultur
Jaringan
Peralatan yang diperlukan dari suatu laboratorium
umumnya adalah sbb.:
1. Hot plate/magnetic stirrer atau kompor
2. Peralatan gelas (gelas ukur, erlenmeyer) atau
stainless steel untuk memanaskan dan melarutkan media
3. Alat sterilisasi dengan tekanan uap (autoclave)
4. pH meter
5. Timbangan (analitical dan bench top loading)
6. Gelas ukur gradual
7. Botol kultur dengan penutupnya
8. Dispenser
9. Alat diseksi (spatula, scalpel (pinset), forcep,
gunting)
10. Refrigerator
11. Distiling unit atau water deionizer
12. Oven
13. Microwave
14. Mikroskop
15. Pipet ukur
16. Shaker
17. Laminar air flow
18. Disinfectant
19. Bahan kimia yang diperlukan untuk pembuatan media
(Lampiran)
20. Dll.
Peralatan gelas yang digunakan di lab kultur jaringan
umumnya terbuat dari Pyrex. Erlenmeyer dari berbagai ukuran (50, 125, 250, 500,
1000 atau 2000 ml) digunakan untuk wadah kultur dan pembuatan media. Tabung
gelas, cawan petri, botol jam atau bekas selai juga sering digunakan sebagai
botol kultur. Peralatan gelas tesebut harus tahan panas selama proses
sterilisasi dengan oven atau autoclave. Peralatan gelas lain yang biasanya
digunakan adalah gelas piala, gelas ukur, pipet dan labu ukur.
3. Prosedur Dasar Laboratorium
Umumnya penggunaan operasional di lab perbanyakan
tanaman dengan kultur jaringan dapat dipelajari dengan mudah. Hal yang paling
perlu diperhatikan adalah akurasi, kebersihan dan keamanan saat bekerja dengan
teknik kultur jaringan. Penimbangan Pada saat pembuatan media, semua bahan yang
ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati meskipun untuk pembuatan media dalam
skala komersial. Setiap penggunaan timbangan atau alat-alat lain harus
memperhatikan instruksi dari pabrikannya.
Jenis timbangan yang sering digunakan di lab antara
lain top-loading balance dan analytical balance yang memungkinkan akurasi
penimbangan hingga skala milligram. Beberapa persyaratan yang harus
diperhatikan agar diperoleh penimbangan yang akurat adalah (i) timbangan harus
ditempatkan pada tempat yang keras, stabil, permukaannya rata yang bebas
getaran dan kebocoran, (ii) daerah sekitar penimbangan harus terjaga
kebersihannya, (iii) yang terpenting lagi, penimbangan jangan sampai pernah
overload, (iv) penimbangan disarankan menggunakan wadah atau alas yang ringan
atau kertas daripada menempatkan bahan yang ditimbang secara langsung di atas
piring timbangan.
Pengukuran cairan/larutan Peralatan gelas yang
mempunyai ukuran seperti gelas piala, erlenmeyer dan pipet diperlukan untuk
pembuatan media. Gelas ukur kapasitas 10, 25, 100 dan 1000 ml banyak digunakan
untuk mengukur volume, tetapi pengukuran yang lebih akurat diperlukan labu ukur
dan pipet. Pengukuran larutan dengan menggunakan pipet dan labu ukur hanya akan
akurat apabila bagian dasar dari cekungan antara air dan udara berada tepat
pada tanda pengukuran. Penggunaan pipet harus dibantu dengan alat penghisap
larutan (pipetor). Jangan pernah menggunakan mulut untuk memipet. Jenis-jenis
pipetor yang umum digunakan antara lain (i) tipe bola penghisap yang dilengkapi
dengan beberapa katup pengontrol, (ii) pipet penghisap yang dioperasikan
menggunakan roda kecil pada bagian atas alat penghisap, (iii) alat penghisap
dengan bantuan pompa udara secara elektrik. Cairan dihisap kedalam pipet dengan
menekan tombol bagian atas dan melepaskan cairan dengan menekan tombol bagian
bawah, (iv) pipet mikro, biasanya untuk pengambilan larutan dengan volume yang
sangat kecil (mikro liter).
Membersihkan peralatan gelas Metoda konvensional
pencucian peralatan gelas dilakukan dengan merendam gelas dalam larutan asam
kromat yang diikuti pembilasan dengan air kran dan air destilasi. Karena asam
kromat dapat menyebabkan korosif, maka cara ini banyak ditinggalkan kecuali
untuk peralatan gelas yang terkontaminasi tinggi. Pencucian yang lebih aman
adalah dengan air panas (>70oC) + sabun, diikuti dengan pembilasan dengan
air panas dan air destilasi. Peralatan gelas yang telah dicuci, dikeringkan dalam
oven pada suhu 150oC dibungkus dengan aluminium foil, kemudian disimpan dalam
lemari tertutup.
Sterilisasi Bagian yang sangat penting dalam teknik in
vitro adalah sterilisasi bahan tanaman dan media dan menjaga kondisi aseptik
yang telah dicapai. Bakteri dan jamur adalah dua kontaminan yang paling banyak
dijumpai dalam kultur. Spora jamur sangat ringan dan ada disekeliling
lingkungan. Apabila spora jamur kontak dengan media kultur dan kondisinya
optimal untuk perkecambahan jamur, maka akan terjadi kontaminasi.
a. Sterilisasi Ruang Kultur dan Transfer
Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah
dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). Waktu sterilisasi
bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus
dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. Radiasi UV sangat
berbahaya bagi mata dan kulit. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan
mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida)
komersial. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan
lampu UV, sehingga sterilisasinya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan
membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 95%
sebelum mulai bekerja. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap
dengan Na-hypoklorit 2% (merek komersial seperti Sunclin, Bayclin atau
pembersih lantai lain yang mengandung disinfektan) atau alkohol 95%. Lantai
ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang sama.
b. Sterilisasi Peralatan Gelas dan Peralatan
Lain.
Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium
foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu
130o-170oC selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di
oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada
suhu 170oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk
bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan
diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah
disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian
dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame
sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena
alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan
menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi
dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari
nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media
kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan
tekanan 15 psi selama 15-20 menit.
c. Sterilisasi Media
Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum
digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air
destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan
menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan
tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus
menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu
121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang
dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter)
selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat
mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat
thermolabile.
Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok
protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang
bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila
disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter.
Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah
satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat
thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi
dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave.
Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile,
dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable
disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada
kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi
yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile
disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi
dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik. d
d. Sterilisasi Bahan Tanaman
Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal
yang sulit. Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur
akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. Organ atau
jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan, karena sebagai
bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang ekstrim.
Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan,
sehingga waktu perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena
tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi. Larutan yang
digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh
kontaminan baik bakteri maupun jamur. Untuk tanaman berkayu, umbi dll. biasanya
sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu
dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis
herbaceous. Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam
sterilan, dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurang-kurangnya
tiga kali.
Menentukan pH larutan pH larutan diukur berdasarkan
konsentrasi ion hidrogen dalam larutan. Skala pH mulai dari 0 (sangat asam)
hingga 14 (sangat basa) dan skala 7 adalah titik netral. pH dari media kultur
umumnya diatur 5.7 ± 0.1 sebelum diautoclave. pH dapat memengaruhi kelarutan
ion-ion di dalam media, kemampuan agar untuk menjadi gel dan selanjutnya
mempengaruhi pertumbuhan sel-sel. Oleh karena itu akurasi pH media menjadi
faktor yang penting untk diperhatikan. Umumnya pengukuran pH media menggunakan
pH meter.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar